遠心分離法の使い分け【物質の分離と物質の精製】

遠心分離法の分類
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遠心分離法の使い分け【物質の分離と物質の精製】

 

遠心分離法の使い分けがよく分かりません.

本記事は,このような「なぜ?どうして?」にお答えします.

 

こんにちは.

博士号を取得後,派遣社員として基礎研究に従事しているフールです.

皆さんは,どのような用途で遠心分離法を使ってますか?

 

どのような用途?遠心分離は,物質を沈めて分離するだけでしょ?

 

このように思った方に本記事はオススメですよ!

実は,遠心分離法は4種類に分けられます.

ペレッティング法・浮上分画法・沈降速度法・等密度遠心分離法です.

そして,遠心分離法は「物質を分離する」だけではありません.

「物質を精製する」こともできるんです!

この記事では,4種類の遠心分離法についてまとめました.

本記事を読み終えると,遠心分離法の分類が分かり,実験系に合わせて使い分けることができますよ.

 

サマリー・ペレッティング法は,溶液中の重い粒子を沈降させる方法です.

・浮上分画法は,溶液中の密度が小さい粒子を浮かせて分離する方法です.

・ペレッティング法や浮上分画法では分離が難しいとき,沈降速度法や等密度遠心分離法を使います.

遠心分離法の分類

遠心分離法は,大きく2つに分けられます.

① 分画遠心法
② 密度勾配遠心法

分画遠心法

分画遠心法には,2つの分離法があります.

a) ペレッティング法
b) 浮上分画法

密度勾配遠心法

密度勾配遠心法にも,2つの分離法があります.

c) 沈降速度法
d) 等密度遠心分離法

1つずつ見ていきましょう!

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ペレッティング法

ペレッティング法による遠心分離

ペレッティング法は,日常的に皆さんが行っている,いわゆる普通の遠心分離法です.

特別な方法ではありません.

図のように,溶液中の重たい粒子を沈降させることができます.

ペレッティング法を行う場合,スウィングローターよりもアングルローターを使うことをオススメします.

メリット

  • 必要な目的物を沈降物として回収することができます.
    • 細胞の回収
    • プラスミド抽出のために培養した大腸菌の回収

 

  • 不要な物を沈降させて上清から回収することができます.
    • 細胞ライセートの不溶画分の除去

デメリット

  • 粒子サイズごとに沈降物を分離することができない.

浮上分画法

浮上分画法による物質の分離

浮上分画法は,溶液中の密度が小さい粒子を浮かせて分離する方法です.

生理食塩水などの密度調整液をサンプルに加えて遠心すると,その調整液の上層に密度が小さい粒子が浮上してきます.

密度が小さい粒子だけを回収することもできれば,密度が小さい粒子を除いた沈降物を回収することもできます

学生のとき,生化学実験で血清中のリポタンパクを分離する実験を行いました.

先ず,生理食塩水(0.9% NaCl溶液)を密度調整液としてVLDLを分離し,下層の沈降物を回収して,別の密度調整液(17% NaCl溶液)を加えてLDLを分離するという内容でした.

当時は何をやっているのか不明でしたが(笑),今は理解していますよ!

メリット

  • 粒子サイズごとに沈降物を分離することができます.
    • 血清中のリポタンパク質を分離

デメリット

  • 対象とする粒子の沈降係数の差が大きい場合にのみ有効な方法です.
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沈降速度法

沈降速度法による物質の分離

沈降速度法は,粒子の沈降係数の違いに基づいて分離する方法です.

先ず,遠心管内に,上部から下部へ密度が大きくなる密度勾配をつくります.

この密度勾配は連続の場合もあれば,段階的(5-10%刻み)の場合もあります.

最上層にサンプル溶液を載せ,これを遠心します.

沈降係数が大きい粒子ほど早く沈降するので,遠心後は,沈降物がバンド状になって分離されています

密度勾配液としては,ショ糖溶液やグリセロール溶液が使われます.

なお,沈降速度法で遠心する場合は,スウィングロータを使いましょう!

メリット

  • 粒子サイズごとに沈降物を分離することができます.
    • 細胞小器官の分離
    • ウイルス粒子の精製

デメリット

  • 密度勾配の作製は,意外と難しい.
  • 遠心時間が長過ぎると全部沈降してしまう.
  • 乗せることのできるサンプルの容量が少ない.

パーセント濃度

密度溶液のパーセント濃度には注意は必要ですよ!

重量対体積百分率濃度(容量% [w/v])で書く人もいれば,重量百分率濃度(質量% [w/w])で書く人もいます.

数値だけを見て密度溶液を調整すると大変なことになりますよ(笑).

【応用】クッション法

デメリットで「乗せることのできるサンプルの容量が少ない」と書きました.

何度も何度も沈降速度法を実施するのは面倒だし,大変ですよね.

その解決策として,クッション法という応用が存在します.

目的とする粒子の性質(遠心時間や分布する密度)がすでに分かっている必要がありますが.

この方法は,密度勾配を2層に減らせるので,その分だけサンプルの持ち込み量を増やすことができます.

等密度遠心分離法

等密度遠心分離法による分離

等密度遠心分離法は,遠心中に自然と形成される密度勾配を利用する方法です.

遠心が平衡状態となると,粒子の密度と等しい媒体の密度部位に粒子が集まります.

密度勾配液としては,塩化セシウム溶液フィコール・コンレイ液が使われます.

メリット

  • 粒子サイズごとに沈降物を分離することができます.
    • プラスミドDNAの濃縮
    • PBMC分離
  • 密度勾配の作製する必要がない.
  • スウィングローターとアングルローター,どちらでも出来ます.

デメリット

  • 密度勾配を形成する媒体と粒子との間に相性があり,目的に応じて使い分けが必要です.

もっと勉強したい方へ

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以上,遠心分離法の使い分け【まとめ】でした.

最後までお付き合いいただきありがとうございました.

次回もよろしくお願いいたします.

2020年5月5日 フール