緩衝液に添加する変性剤の役割【意外とよく使う変性剤】(1)

緩衝液に添加する変性剤の役割
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緩衝液に添加する変性剤の役割【意外とよく使う変性剤】(1)

 

変性剤

変性剤?何それ?使ったことないんだけど…

本記事は,このような「なぜ?どうして?」にお答えします.

 

こんにちは!

博士号を取得後,派遣社員として基礎研究に従事しているフールです.

以下は,私が使用しているRNA抽出キットの説明書に記載されているものです.

If purifying RNA from cell lines rich in RNases, we recommend adding β-mercaptoethanol (β-ME) to Buffer RLT before use.

Dithiothreitol (DTT) can be used instead of β-ME.

Buffer RLT contains guanidine thiocyanate, …, and Buffer RW1 contains a small amount of guanidine thiocyanate.

  • β-ME
  • DTT
  • Guanidine thiocyanate

どれもRNA分解酵素(RNase)を阻害するために添加するタンパク質変性剤ですね.

「説明書に書いてあったから」という理由で,機械的に加えている人も多いと思いますが…

これがキットを利用するデメリットですね.

キットを使うことが当たり前になると,これらの試薬を加える理由を考えることを忘れがちです.

・説明書に書いてあったから.
・先生や先輩に言われたから.

・そういうものだと思ってた.

良くない傾向ですね~(笑).

誰が使っても出来るのがキットですから,それでも良いのでしょう.

でも,研究に従事する者,特に研究者を目指す者が,あたかも「そういうもの」と認識してしまうのは問題だと思います.

そこで,今回と次回で緩衝液に加える「変性剤」をまとめます.

 

サマリー・タンパク質の変性剤として,還元剤やグアニジン塩酸塩などを使うことがあります.

還元剤

2-メルカプトエタノール(2-ME)ジチオスレイトール(DTT)が有名ですね*1, 2

タンパク質のジスルフィド結合(S-S結合)を切断することで,タンパク質の立体構造を壊します(正確には,「タンパク質の変性させる」と言います).

界面活性剤と合わせて使用することで,タンパク質の変性を促進します.

そして,プロテアーゼインヒビターとの組み合わせは注意してください.

還元剤が存在するとプロテアーゼインヒビターの活性が阻害されるもの,逆にプロテアーゼインヒビターの活性発現に還元剤が必要なものがあります.

詳細は以下の記事をご覧ください.

緩衝液に添加するプロテアーゼインヒビターの種類と役割
緩衝液に添加するプロテアーゼインヒビターの役割についてまとめました.なぜ,緩衝液にプロテアーゼインヒビターを加えるのでしょうか?もちろん,「おまじない」ではありません.

*1β-メルカプトエタノール・2-メルカプトエタノール・チオグリコールは,全部同じものです.

*2DTTは,2-MEよりも還元力が強いです.また,2-MEは政令(毒物及び劇物指定令)により毒物に指定されているので,取り扱いが面倒です.よって,最近はDTTを使う研究室が多いのではないでしょうか.

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グアニジンチオシアネート・グアニジン塩酸塩

タンパク質の変性剤です.

RNA抽出のときに,RNA分解酵素(RNase)を阻害するために使用します.

還元剤と合わせて使用することで,RNaseを含むあらゆるタンパク質を変性させることができます.

グアニジンがRNA中に残留*3すると,cDNA合成を阻害するので,洗浄工程は丁寧に行いましょう!

*3吸光度によるRNAの純度評価をするときにも問題となります.グアニジンは,230-280 nmの吸光度に影響するので,正確な測定結果が得られません.詳しくは【ナノドロップ】波形データの見方でまとめています.

 

以上,緩衝液に加える変性剤(1)でした.

最後までお付き合いいただきありがとうございました.

次回もよろしくお願いいたします。

2020年1月5日 フール