PCRの非特異なバンド【PCRの失敗】

PCRの非特異なバンド
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PCRの非特異なバンド【PCRの失敗】

 

PCRしたら,目的サイズとは別のバンドも出てきた.どうして?

本記事は,このような「なぜ?どうして?」にお答えします.

 

こんにちは.

博士号を取得後,派遣社員として基礎研究に従事しているフールです.

以下は,PCR法について簡単に説明したものです.

PCR法は,DNAをサンプルとした遺伝子検査の1つです.特定のDNA断片だけを選択的に増やすことできます.

実験初心者の多くは,この説明を聞き,PCR法は万能だと思うようです(笑).

確かに,上記の説明は間違っていません.

ただ,これには「適切な反応条件の下で」という言葉が隠れています

「適切な反応条件」が整っていないと,「テキトーなDNA断片をただ増やすだけ」になります.

その結果,非特異なバンドとして認識されるわけです.

今回は,PCRで非特異なバンドが出る理由(原因)についてまとめました.

 

サマリー・プライマーのデザインに問題があるかもしれません.

・PCRの反応条件に問題があるかもしれません.

本日の課題

あなたは,以下の実験結果をどのように解釈しますか?

そして,どのようなトラブルシューティングが必要だと思いますか?

PCRの非特異なバンド

図1 遺伝子y*の検出のため,新規プライマーを使ったPCRの結果
S:サイズマーカー
レーン1:プライマーのみ(PCR反応なし)
レーン2:プライマーのみ(PCR反応あり:cDNAを加えていないPCR反応)
レーン3-6:サンプル(RNAを逆転写したcDNA)*
レーン7:ポジティブコントロール(遺伝子yを持った組換えプラスミド)*
レーン8:ネガティブコントロール(遺伝子yを持たない組換えプラスミド)*
ゲル:1.5% アガロースゲル in TAE
泳動:100 V, 25分間
染色:EtBrの後染め

*目的遺伝子yのサイズは,約1500 bp である.

*培養細胞から抽出したトータルRNA 500 ng をインプットとして cDNA 合成を行い,PCR検査には,25 ngのcDNAを使用した.

*PCR検査では,25 ngのプラスミドを使用した.

フールの解説

結果の見方は,全部で5つのステップがありましたね.

前回同様に1つずつみていきましょう.

①初めに見る所のは,サイズマーカーのレーン

サイズマーカーの確認

全てのサイズマーカーがキレイに泳動されていますね.

ココから,増幅されたPCR産物も同様に泳動されていると考えることができるんでしたね.

②ポジティブコントロールと③ネガティブコントロールを確認

ポジコンとネガコンの確認

②ポジティブコントロールのバンドが,予想される位置(図1の*を参照)にキレイに検出できています.

これは,本実験のプロトコールが正常にワークしていることの証でした.

 

③ネガティブコントロールレーンは,残念ながらバンドが1つ出ていますね.

ネガティブコントロールでバンドが検出されないことは,プライマーの非特異的な結合による増幅やクロスコンタミネーションが無いという証でした

これにより,本実験結果の正確性を保証していたのですが…

加えて,レーン2-8で同様のバンドが検出されています.

これは,ネガティブコントロールだけの問題ではありませんね.

④サンプルとポジティブコントロールを比較

ポジコンとサンプルの比較

サンプル(レーン 3-6) で確認できたバンドの位置を,ポジティブコントロールのバンドの位置と比較するんでしたね.

サンプルレーンのバンドとポジティブコントロールのバンドの位置が同じですね.

サンプルでは遺伝子yが転写されていたと解釈することができます

⑤余計なバンドの解釈の仕方

さて,ネガティブコントロールを始め,レーン2-8で見られたバンドについてです.

サイズが,ポジティブコントロールのそれとは違うので,ポジティブコントロールのクロスコンタミネーションではありませんね

それでは,このバンドの正体は,いったい何でしょうか?

そこでレーン1と2に注目してください!

プライマーダイマーの検証

本実験では,新たにプライマーを合成しています.

そのプライマーがプライマーダイマーを形成するかどうかを検証するために,レーン1と2を用意しています.

レーン1は,プライマーのみを泳動しているレーンです.

レーン2は,プライマーのみでPCR反応を行った産物を泳動しているレーンです.

当たり前ですが,レーン1ではプライマーが検出されています.

レーン2では,プライマーよりもサイズの大きい何かが検出されています.

ココには,サンプルのcDNAは入っていません.

よって,これはプライマー同士が結合したプライマーダイマーであると考えることができます.

プライマーダイマーの確認

レーン3-8で見られたバンドは,レーン2と同じ位置に検出されているので,これらは全てプライマーダイマーであると考えることができます.

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トラブルシューティング

プライマーダイマーができる要因は,以下の2つです.

① プライマーデザイン
② アニーリング温度など反応条件

プライマーデザイン

プライマーデザインの問題として,「プライマーに相補配列が多い」場合は,プライマーダイマーが生じやすくなります.

プライマーの相補配列は,3ベース以下となるように設計しましょう.

アニーリング温度など反応条件

反応条件の問題として,以下の2点があります.

(1)アニーリング温度が低い
(2)ホットスタート法を採用していない

アニーリング温度が低い

一般にアニール温度は,プライマーの Tm 値から-5℃と言われます.

しかし,余計なバンドプライマーダイマーが生じている場合は,Tm 値を上げることを検討してください.

ホットスタート法を採用していない

プライマーどうしまたはプライマーと鋳型DNAが低温で結合し,PCRが開始してしまうことがあります.

これをを防ぐ目的で,高温になるまで酵素反応を開始させない工夫をします.

それをホットスタート法といいます.

私の知る限りホットスタート法には,以下の4つがあります.

A. ワックス法
B. 抗体結合耐熱性酵素を用いる方法
C. 高温下で不足しているコンポーネントを追加する方法
D. 加熱処理後に活性化する組換えDNAポリメラーゼを用いる方法

AとCは,ポリメラーゼの種類が限られていた時代に行われていた古典的な方法です.

私も,勉強のために数回しか経験はありません.

「やるな!」と言いませんが,オススメはしません(笑).

近年は,BとDが主流だと思います.

プライマーダイマーがあっても実験結果に影響しない場合

プライマーダイマーがあっても実験結果に影響しない場合があります.

例えば,PCR反応の目的が遺伝子クローニングの場合です.

目的の断片が増幅されれば,それを切り出して精製すれば良いので.

逆に,プライマーダイマーがあって問題となるのは,見栄えが悪くなることでしょう.

近年は,PCRの結果を論文等に載せることが稀なので,あまり問題にはならないでしょうが…

それでも実験の生データは残しておくべきなので,その見栄えが悪いと見返したときに指摘されるかもしれません.

「配列に特異的なプライマーを使っているのに,どうして別のバンドがあるの?」って(笑).

本記事を読んだ方は,回答に困りませんね!

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以上,PCRの非特異なバンドのトラブルシューティングでした.

最後までお付き合いいただきありがとうございました.

次回もよろしくお願いいたします.

2020年3月28日 フール