核酸電気泳動でサイズマーカーがはっきり現れない

核酸の電気泳動でサイズマーカーが見えない(見えにくい)
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核酸電気泳動でサイズマーカーがはっきり現れない

こんにちは.

博士号を取得後,派遣社員として基礎研究に従事しているフールです.

久しぶりにサイト訪問者の方から,リクエストを頂きました

電気泳動をした(アガロースゲル,1kb DNA Ladder)が,マーカーのバンドがはっきり現れず,マーカーの役割を果たしてくれません.どうしてでしょうか?

ご質問頂きありがとうございました!

ご質問者は,核酸電気泳動のサイズマーカーについてお悩みのようです.

もう少し詳細な条件(使用している染色の種類・ローディングバッファーの種類,泳動条件など)も知りたかったのですが…

それによりトラブルシューティングも変わるので!

ただ,良い機会なので,これまで私が経験した失敗談をまとめることにしました.

本記事では,核酸電気泳動でサイズマーカーのバンドがはっきり現れない原因そのトラブルシューティングをまとめます!

サイズマーカーのバンドがはっきり現れない原因

私も,DNAの電気泳動でサイズマーカーのバンドがはっきり現れなかったことがあります.

これまでの私の経験から,その原因は以下の4つであることが多いです.

① 電気泳動の失敗
② バックグラウンドが高すぎる
③ 染色試薬とサイズマーカーの相性
④ サイズマーカーとローディングバッファーの相性
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電気泳動の失敗

核酸の電気泳動でサイズマーカーが見えない

以下の2種類があると思います.

① サンプル・サイズマーカーが共に見えない
② サンプルの泳動は上手くいってるけど,サイズマーカーが見えない

①は電気泳動自体が上手くいってませんね.

私は,「電極がパワーサプライと正しく繋がっていなかった」という経験があります(笑).

②は厄介です.

サイズマーカー特異的なので,失敗する要因は複数あります.

例えば,

  • 使用量が少なかった
  • サイズマーカーが分解していた

などが考えられますね!

それでは,1つずつ説明していきます.

電極がパワーサプライと正しく繋がっていなかった

赤の端子黒の端子逆につけていたり,ウェルがプラス電極側にあったりする場合です(笑).

電気泳動自体が上手くいかないので,当然バンドをみることはできません.

機器の取り扱いやゲルの配置を確認してください!

使用量が少なかった

量が少なくて見えていないだけのパターンですね!

使用する染色試薬にもよりますが,バンドとして検出するには100~300 ngの使用が必要です.

サイズマーカ―の説明書には,サイズマーカーの濃度が記載されていると思います.

先ずは,使用量を確認しましょう!

サイズマーカーが分解していた

これは保存方法が不適切だったり,細菌由来のヌクレアーゼがコンタミしたことによる場合です.

サイズマーカーは,商品ごとに保存方法が異なります.

室温保存から凍結保存まで色々ありますので,保存方法が違っていた場合は新しくするのもアリでしょう!

特に細菌由来のヌクレアーゼがコンタミした場合,これはクリティカルな要因となるので気を付けましょう!

サイズマーカーって結構高いんですよ!

バックグラウンドが高すぎる

バックグラウンドが高くてバンドが見えにくい

自家蛍光が強い染色剤(EtBrなど)を利用している場合,さらにアガロースゲルを節約して使いまわしている場合にぶつかる現象です.

バンドが,高いバックグラウンドのせいで隠れてしまっているパターンですね.

ゲルを脱色する,または自家蛍光の低い染色剤を使用することで改善できます.

アガロースゲルを節約して使いまわしている場合は,工夫が必要です.

以前に使用した染色剤が残っていますから,サンプルやサイズマーカーを泳動する前にゲルだけでプレ泳動しましょう!

多くの染色剤はプラスに荷電しているので,プレ泳動により染色剤をゲルの外に追い出すことが可能です.

染色試薬とサイズマーカーの相性

核酸の電気泳動でサイズマーカーが泳動されない

染色剤によっては,先染めプロトコール(ゲル内染色法)で泳動すると変な像になることがあります

これは,Gel Red・Gel Greenの使用を検討した時の話です.

先染めも可能であると説明書に書いてあったので,先染めプロトコールで泳動しました.

そしたらバンドが歪んだり,バンドがキレイに分離されずスメア状になったりしました(サンプルのバンドは,キレイでした.).

説明書には,DNA量が多いと泳動が乱れるとあったので,使用量を落として検証しました.

すると,バンドを確認することはできましたが,使用量によって移動度が異なるという問題にぶつかりました(プラスに荷電した染色剤は,サンプルやラダーをマイナス側に引っ張ります).

仕方ないので,先染めではなく後染め(泳動後染色法)にしました.

その結果,とてもキレイな像を得ることができました!

現在は,後染め法を採用しています.

長くなりましたが,トラブルシューティングとしては,① 染色剤を変えてみる,② 先染めで泳動している方は後染めを検討するを提案します.

ゲルの下半分だけバンドが見えない

核酸の電気泳動で低分子のサイズマーカーが見えない

これは,EtBrを使った先染めプロトコールでよく経験しました.

繰り返しになりますが,多くの染色剤はプラスに荷電しています.

だから,ゲルに混ぜた染色剤は核酸とは反対の向きに泳動されます

長時間泳動すると,ゲル内に染色剤が無い(少ない)領域が形成され,その部分のバンドが不明瞭になります.

染色剤が少ない領域はプラス極側から出来るので,低分子の核酸の検出は影響を受けやすいです.

こちらトラブルシューティングも,後染めを検討です.

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サイズマーカーとローディングバッファーの相性

実は,ローディングバッファーには色々な種類があります.

主な違いは,以下の通りです.

  • SDSの有無
  • イオン強度
  • 含まれている色素の種類
  • 使用している沈殿試薬の種類

SDSの有無

SDSが入っていると都合が悪い場合があります.

例えば,核酸と何かの複合体を電気泳動する時です.

SDSが入ってると複合体が壊れます…

逆に,SDSが入っていないと都合が悪い場合もがあります.

例えば,制限酵素処理産物です.

一部の制限酵素はDNA と強く結合します.

SDSが入っていないと制限酵素とDNAの結合を乖離できず,正しく電気泳動できません.

サイズマーカーは,制限酵素処理で作製している場合が多いです.

だから,SDSが入っていないローディングバッファーでは正しく電気泳動できない可能性があります.

SDSが入っているローディングバッファーで検討してみてください!

イオン強度

泳動緩衝液よりもイオン強度が強いローディングバッファーがあります.

商品ごとに組成が異なるので,取扱説明書をご覧ください!

また「イオン強度が強くなってしまう」ことがあります.

6xと10xを取り違えて希釈率を間違えたとか,泳動緩衝液を節約していて0.25~0.5xで使用している場合です.

イオン強度が強すぎると,バンドがぼやけたりします.

含まれている色素の種類

核酸の電気泳動でサイズマーカーが隠れている

多くのローディングバッファーには,電気泳動の進行具合を知るための色素が入っていますね.

有名なのは,Bromophenol blue・Xylene cyanol・Orange Gなどでしょうか.

何が違うのかと言うと,見かけの分子量が異なります.

サイズマーカーに限りませんが,分子量と使用量によっては,色素が目的のバンドを隠してしまうことがあるので要注意です.

使用している沈殿試薬の種類

沈殿試薬としてはグリセロールが有名ですが,スクロースやフィコールも使用されます.

正直,私もこれらの使い分けはできてません(笑).

そして,サイズマーカーとの関連は分かりません.

ただ,TBEバッファーで泳動するときは,グリセロール以外に沈殿試薬を使用したローディングバッファーを使用します.

グリセロールは,ホウ酸と相互作用してpHを変化させるかもしれないので.

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以上,サイズマーカーのバンドがはっきり現れない原因でした.

本記事が,ご質問者のトラブルシューティングの役に立てば幸いです.

最後までお付き合いいただきありがとうございました.

次回もよろしくお願いいたします.

2020年8月2日 フール

コメント ~リクエストでも良いですよ~

  1. 【追記】

    ご質問者からお返事があり,実験条件の詳細が送られてきました.

    残念ながら,解決できなかったようです…

    悔しい!

    さて,送って頂いた実験条件の詳細は,以下の通りです.

    ・DNA分子量マーカー(1 kb DNA Ladder,タカラバイオ,1レーンに 10 μL)
    ・ローディング溶液(0.25%ブロモフェノールブルー,30%グリセロール,5mM EDTA,pH8.0
    ・0.7%アガロースゲル(アガロース微粉末,ナカライテスク)
    ・臭化エチジウム(EtBr)
    ・泳動バッファー

    うーん…

    正直,お手上げです(笑).

    サイズマーカーを10 μLってのは多過ぎな気がしますが…

    これは本格的にトラブルシューティングが必要ですね!

    宜しければ,以下の質問にお答えください!

    ① サイズマーカーは,全く見えないのですか?それとも薄っすら見えるのですか?
    ② サイズマーカーだけが見えないのですか?サンプルのバンドも見えないのですか?
    ③ 研究室内の別の人が,そのサイズマーカーを使った場合,上手くいくのですか?
    ④ 泳動条件の詳細(電圧数,泳動時間,泳動バッファーの種類,先染め or 後染め)を教えてください!
    ⑤ アガロースゲルを,どのようにして作っているのか教えてください!
    ⑥ 撮影装置は,問題なく機能していますか?
    ⑦ 撮影するとき,ゲルを鋳型から外していますか?

    ココを介したやり取りとなってしまい恐縮ですが,よろしくお願いいたします!

    20200803 フール