qPCRの解析【ΔΔCt法】をExcelで行う方法を解説
qPCRのΔΔCt法の計算方法は具体的にどうすればいいんですか？
こちらの疑問に本記事でお答えしています．
本記事の内容・ΔΔCt法の計算方法
・ΔΔCt法の標準偏差の計算方法
こんにちは．
博士号を取得後，派遣社員として基礎研究に従事している元研究者のフールです．
最近，qPCRのΔΔCt法の計算方法に関する質問がいくつかありました．
ΔΔCt法の具体的な計算方法が見つからないので教えてほしい．
細かい内容はそれぞれ異なりますが，依頼内容は上記のような感じです．
最近の機器は優秀なので，Run終了後は解析も終了しています．
一方で，解析は有料ソフトウェアの購入が必要だったり，プレートデザインの関係で複数の実験系が混在しているなど，解析は自分でやらないとダメなケースはありますよね！
この記事では，ΔΔCt法の解析をExcelで行う方法をご紹介します．
サマリー・ΔΔCt法では，サンプル内補正とサンプル間の補正をする必要があります．
ΔΔCt法の具体的な解析方法（基礎編）
ハウスキーピング（HK）遺伝子のどれかをサンプル内補正に使う内部標準として使います．
ハウスキーピング遺伝子の選定に関しては，以下の記事をご覧ください．
次に，サンプル間補正を行います．
Contorlでの標的遺伝子の転写量を1とした場合の各Groupにおける転写量を比較します．
例えば，次のような感じです．
Excelで入力している具体的な数式は次の通りです．
補正を行うのに，どうして引き算？
割り算ではないの？
ΔΔCt法では，1サイクル（1Ct）の違いで差が2倍になるという前提条件を利用しています．
結果は2を底として指数を意味していて，例えば，「30.94」 は「230.94」です．今回の引き算は「乗数項の引き算」に該当するので，指数法則より「指数の割り算」をしていることになります．
なるほど～「30.94-23.36」 は「230.94÷223.96=230.94-23.36」って意味なんですね！
ΔΔCt法の具体的な解析方法（応用編）
さて，ここからが本番です！
実験のサンプル数が N=1 ならば，上記の解析方法で問題ありません．
しかし，現実は違いますよね！
N=3 とか N=5 のような実験が多いのではないでしょうか？
そして，平均値だけでなく，標準偏差やは標準誤差も算出したいはずです．
これから N=3 の場合の解析方法を2通り紹介します．
- ΔΔCt 値で解析する場合
- 2-ΔΔCt 値で解析する場合
ΔΔCt 値で解析する場合
ΔΔCt 値で解析する場合は，次の通りです．
Excelで入力している具体的な数式はこんな感じです．
ΔCt値の平均値を算出し，各ΔCt値からControlのΔCt値の平均値を引いてΔΔCt値を算出しています．
そして，得られたΔΔCt値を基に，平均値と標準偏差（SD）を算出した後，2-ΔΔCtに代入します．
大切な点は，求めた標準偏差は対数関数正規分布に従うということです．
これを2-ΔΔCtに代入して真数にすると正規分布しませんので，標準偏差は下限値と上限値の区間として表示する必要があります．
2-ΔΔCt 値で解析する場合
2-ΔΔCt 値で解析する場合は，次の通りです．
Excelで入力している具体的な数式は次の通りです．
先ほどと同じく，ΔCt値の平均値を算出し，各ΔCt値からControlのΔCt値の平均値を引いてΔΔCt値を算出しています．
次に，ΔΔCt値を2-ΔΔCtに代入して各相対比を求めます．
そして，2-ΔΔCtの平均値を求め，各2-ΔΔCt値をControlの2-ΔΔCt値で補正していきます．
最後に，得られた補正値を使って平均値とSDを算出します．
この場合，真数となった後の数値を使って計算していますので，SDを「±」で表現できます．
(1)と(2)はどっちの方が良いんですか？
数学的にはどちらも正しいと思いますが，科学的に妥当なのはどちらなのか…ごめんなさい！私も分かりませんw
2022年4月30日 フール
