バンドが見えないほどメンブレンが黒い【ウェスタンブロットの失敗】

ウェスタンブロットのメンブレンは真っ黒
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バンドが見えないほどメンブレンが黒い【ウェスタンブロットの失敗】

 

真っ黒なメンブレン

メンブレンが真っ黒になっちゃった…どうして?

本記事は,このような「なぜ?どうして?」にお答えします.

 

こんにちは.

博士号を取得後,派遣社員として基礎研究に従事しているフールです.

ウェスタンブロットで,バンドだけでなくメンブレン全体が黒くなってしまったことはありませんか?

黒くなってしまったことで,サイズマーカーやバンドが見えない…

残念ですよね.

本記事は,真っ黒なメンブレンのトラブルシューティングについてまとめました.

 

サマリー・真っ黒な状態を「バックグラウンドが高い」と表現します.

・使用器具や試薬のコンタミネーションが原因の1つです.

本日の課題

あなたは以下の実験結果をどのように解釈しますか?

そして,どのようなトラブルシューティングが必要だと思いますか?

図5 WBによるタンパク質tt*の検出
S:サイズマーカー
レーン1-6:サンプル(培養細胞のライセート)
レーン7:ポジティブコントロール(tt発現細胞のライセート)
レーン8:ネガティブコントロール(ttが非発現細胞のライセート)
1次抗体:抗ttマウスモノクローナル抗体
2次抗体:抗マウス‐HRP標識抗体
検出方法:化学発光法(Chemiluminescence)

*目的タンパク質ttのサイズは80 kDaである.

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フールの解説

全体的に暗いですね…

このような状態を「バックグラウンドが高い」または「バックグラウンドシグナルが高い」と表現します.

それでもバンドは見えています.

これまで同様に,以下の流れを確認してみましょう!

  1. サイズマーカーの確認
  2. ポジティブコントロールの確認
  3. ネガティブコントロールの確認
  4. ポジティブコントロールのバンドとサンプルのバンドの比較

サイズマーカーは?

サイズマーカーの一部は見えていますが,その上下はよく分かりません.

着色があるマーカーならば,その色からサイズが分かることもあります.

しかし,今回の場合,着色もありません.

見えているマーカーが上から(下から)何番目なのか?

分かりません(笑).

残念ながら,このサイズマーカーの情報は正確ではありませんね

コントロールは?

ポジティブ・ネガティブコントロールのレーンはどうでしょうか?

「ポジティブコントロールはバンドが見えて,ネガティブコントロールはバンドが見えない」と思いがちですが...

サイズマーカー同様に,その上下についてはよく分かりません.

もしかしたら,黒くなっている部分に余計なバンドが隠れているかもしれません

残念ながら,コントロールの情報も正確ではありませんね

原因は?

さて,このようにメンブレンが黒くなってしまうのは何故でしょうか?

考えられる原因は複数あります.

使用器具や試薬のコンタミネーション

研究室の規模や運営方針にもよりますが,装置・器具・試薬を共有している所では,使用器具や試薬のコンタミネーションが起こりやすいです.

個人でそれぞれの器具や試薬を購入できるだけの予算がある研究室では,試薬や器具の管理も個人で行うことが可能です.しかし,多くの研究室ではそうはいきません.共有試薬や共有器具は,扱う人が多くなればなるほど,イレギュラーな使い方をする人・雑な扱い方をする人も増えてきます.しかし,誰がいつ・どのように使ったという情報は見えにくくなります

これまでの私の経験では,以下の原因がありました.

  1. ブロッティング装置の管理が不十分だった
  2. メンブレンの振とうに使う容器の洗浄が不十分だった
  3. 泳動バッファーを使いまわしていた
  4. メンブレンを掴むピンセットが汚れていた
  5. 使用する抗体に複数の抗体がコンタミしていた

使用する抗体の濃度が高すぎる

抗体の濃度が高すぎると,非特異的な結合が増えます.

抗体の反応温度が高すぎる

抗体の感度を上げるために37℃で反応させることもあります.

この場合,非特異的な結合も増えます.

二次抗体の非特異的な結合

二次抗体がメンブレンに直接結合してしまうことがあります.

その原因は,後述するブロッキングに原因があることもあります.

ブロッキングが不十分

ブロッキング時間が短いと,ブロッキングされていない部分に抗体の非特異的な結合が起こります.

ブロッキング剤が不適

使用する抗体とブロッキング剤の相性が悪いと,このように黒くなることがあります.

洗浄が不十分

洗浄時間が短すぎたり,適切な洗浄ができていないと,余計な抗体が残存します.

露光時間が長すぎる

感度を高めようとして露光時間を長くしすぎると,バンドだけでなく,メンブレン全体が黒くなります.

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トラブルシューティング

私は,提案するトラブルシューティングは,以下の通りです.

コンタミネーションの可能性を排除

可能ならば,器具や試薬などの全てを新しくしましょう.

実際は,使用する物を1つずつ変えて,新旧の組み合わせで検証するのが賢い方法です.

しかし,ウェスタンブロットは時間がかかる長丁場の実験系なので,あまりオススメはしません

全てを変えて良い結果がでれば,「試薬や器具に問題があった」とざっくりな結論を出すことができます

予算の都合で全て買い替えが難しい場合は,次のようにしてください.

・使用する器具を念入りに洗浄する
・実験した人で上手くいった人を探し,その時の状況を聞く

①器具のコンタミネーションが原因の場合,念入りに洗浄することで解決します.

②直近で上手くいってた人の事情聴取ですね(笑).

試薬の取り扱いについて,詳細に聞いてみましょう.

試薬のコンタミネーションの場合は,これで気が付くことが多いです

抗体の濃度や反応温度の確認

抗体の製品シートを確認し,至適濃度を確認しましょう.

また,抗体と反応させる条件を4℃でオーバーナイトにしてみましょう.

二次抗体の変更

二次抗体がメンブレンに直接結合してしたことが予想された場合,二次抗体を変えましょう.

ロット不良の場合もあるので,同じ商品の別のロットに変えることも有効です.

ブロッキングの方法を変更

ブロッキングの条件を4℃でオーバーナイトにしてみましょう.

ブロッキング剤の変更

抗体によっては,相性が悪いブロッキング剤もあります.

抗体のデータシートを確認し,そのような情報の有無を確認しましょう.

また,ブロッキング剤に0.01-0.1%のTween 20を加えることで改善することもあります.

なぜTween 20を加えるのかについては,以下の記事をご覧ください.

緩衝液に添加する界面活性剤の役割【超まとめ】
緩衝液に添加する界面活性剤の役割についてまとめました.なぜ,緩衝液に界面活性剤を加えるのでしょうか? もちろん,「おまじない」ではありません.

洗浄時間と洗浄方法の見直し

洗浄時間を十分に確保しましょう.

1回の洗浄時間は,3-5分間が基本です.

また,シーソー式や水平式の振とう器を使い,メンブレン全体が洗浄されるように振とうさせましょう

洗浄液を節約しようとして,複数のメンブレンを1つの容器で洗浄することもありますが,あまりオススメはしません

各メンブレンを別々の容器で,確実に洗浄しましょう.

撮影条件の見直し

抗体やサンプルによって,撮影条件(特に露光時間)は変わります.

サンプルが同じでも抗体が異なれば条件は変わります

抗体が同じでもサンプルが異なれば条件は変わります

先ずは露光時間を短めに設定してみてください.

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最後までお付き合いいただきありがとうございました.

次回もよろしくお願いいたしします.

2020年1月13日 フール