PCRのバンドが波状になる【PCRの失敗】

波状のバンド
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PCRのバンドが波状になる【PCRの失敗】

 

PCR産物を泳動したら,バンドが波状になってた.どうして?

本記事は,このような「なぜ?どうして?」にお答えします.

 

こんにちは.

博士号を取得後,派遣社員として基礎研究に従事しているフールです.

久しぶりにトラブルシューティングの記事を書きました.

今回のテーマは,PCR産物を電気泳動した時のバンドの形です.

実験結果に大きな影響は及ぼしませんが,原因が分からないと気持ち悪いですよね!

今回は,PCRのバンドが波状になる理由(原因)についてまとめました.

 

サマリー・コームのお手入れが雑なのかもしれません.

・ゲルからコームを外す時が雑なのかもしれません.

本日の課題

あなたは,以下の実験結果をどのように解釈しますか?

そして,どのようなトラブルシューティングが必要だと思いますか?

PCRのバンドが波状になった

図1 遺伝子z*の検出を確認するために,PCRを行った結果
S:サイズマーカー
レーン1:プライマーのみ(PCR反応なし)
レーン2:プライマーのみ(PCR反応あり:cDNAを加えていないPCR反応)
レーン3-6:サンプル(RNAを逆転写したcDNA)*
レーン7:ポジティブコントロール(遺伝子zを持った組換えプラスミド)*
レーン8:ネガティブコントロール(遺伝子zを持たない組換えプラスミド)*
ゲル:1.2% アガロースゲル in TAE
泳動:100 V, 25分間
染色:EtBrの後染め

*目的遺伝子yのサイズは,約1500 bp である.

*培養細胞から抽出したトータルRNA 1000 ng をインプットとして cDNA 合成を行い,PCR検査には,200 ngのcDNAを使用した.

*PCR検査では,50 ngのプラスミドを使用した.

フールの解説

結果の見方の概要は,今回は省略します.

気になる方は,以前の記事を参照くださいませ.

PCR法の結果の見方

波状のバンドの解釈

それでは,波状になったバンドの原因について考えてみましょう.

どうして,バンドの一部がウネウネしているのでしょうか?

波状になったバンド

 

レーン4と7で見られたバンドは,バンドが波状になっていますね.

これはPCR反応に原因があるのではなく,電気泳動に原因があります.

より正確に言うと,ゲルの作り方に問題があります.

実はこれ,ゲルからコームを外すときに,ウェルの一部が破壊されている証拠なんです!

コーム外す際にウェルが破壊される原因は3つあります.

  • コームのお手入れができていない
  • コームの取り外し方が雑
  • ゲルの固化時間不足

コームのお手入れができていない

皆さんは,コームの歯をキレイにしていますか?

コームを取り外したら,ちゃんと洗浄していますか?

何も付いていないと考えて,DWで濯ぐだけってことはありませんか?

実は,コームにはアガロースが付着しています

肉眼では何も付いていないように見えますが…

コームの歯をちゃんと洗浄しないと,付着したアガロースは乾燥するだけでコームの歯に残ったままです.

その乾燥アガロースは,次にアガロースゲルを作製する時に,作製されたゲルと結合します.

そして,コームを外すときに,乾燥アガロースの一部がウェルを破壊するのです.

洗浄するときは手袋を装着

時々,手袋を付けずに実験器具を洗う人を見かけます.

止めてください!

なぜなら,皮膚の角質を塗布しているだけだからです.

食器などを洗う場合は,それでも良いのかもしれませんが(笑).

でも実験器具の場合,角質は立派な汚れです.

アガロースは落とした.

でも,角質は付着した.

意味ないですよね(笑).

 

コームの取り外し方が雑

コームを外すときは細心の注意を払っていると思いますが…

忙しない時には雑になることもありますよね!

コームを,垂直ではなく斜めに引き上げたり,左右どちらかに偏った引き上げ方をしたりすると,ウェルが壊れる原因になります.

ゲルの固化時間が足りない

コームをゲルから外す前には,室温で最低でも1時間は静置してください.

急ぎの実験で,どうしても早めたい場合は,4℃で最低でも30分は静置してください.

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トラブルシューティング

私が提案するトラブルシューティングは,以下の通りです.

① コームを洗浄する
② ゲルの固化時間を確保し,コームを丁寧に外す.

コームを洗浄する

実験室にあるコームを洗浄しましょう!

使用者が多くなればなるほど,器具を雑に扱う人も増えます.

明日は仕事納めのラボも多いと思うので,実験器具の煤払いを兼ねた全コームの洗浄も良いかもしれませんね(笑).

固化時間を確保する

ゲルの固化時間をノートに書く人は多くありません.

私も「60分以上静置した」と書くことはありますが,正確な時間までは書いていません.

でも,もし固化時間に原因があると思うなら,ぜひタイマーを設定してください.

30~60分を確実に確保できます.

使用しているゲルにも,色々なクセがあるかもしれません.

一度時間を測って,ゲルを破壊しない最短時間を知っておくのもアリだと思いますよ!

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以上,PCRのバンドが波状になったトラブルシューティングでした.

最後までお付き合いいただきありがとうございました.

次回もよろしくお願いいたします.

2020年12月27日 フール