PCRのバンドが波状になる【PCRの失敗】
PCR産物を泳動したら，バンドが波状になってた．どうして？
本記事は，このような「なぜ？どうして？」にお答えします．
こんにちは．
博士号を取得後，派遣社員として基礎研究に従事しているフールです．
久しぶりにトラブルシューティングの記事を書きました．
今回のテーマは，PCR産物を電気泳動した時のバンドの形です．
実験結果に大きな影響は及ぼしませんが，原因が分からないと気持ち悪いですよね！
今回は，PCRのバンドが波状になる理由（原因）についてまとめました．
サマリー・コームのお手入れが雑なのかもしれません．
・ゲルからコームを外す時が雑なのかもしれません．
本日の課題
あなたは，以下の実験結果をどのように解釈しますか？
そして，どのようなトラブルシューティングが必要だと思いますか？
図1 遺伝子z*の検出を確認するために，PCRを行った結果 S：サイズマーカー レーン1：プライマーのみ（PCR反応なし） レーン2：プライマーのみ（PCR反応あり：cDNAを加えていないPCR反応） レーン3-6：サンプル（RNAを逆転写したcDNA）* レーン7：ポジティブコントロール（遺伝子zを持った組換えプラスミド）* レーン8：ネガティブコントロール（遺伝子zを持たない組換えプラスミド）* ゲル：1.2% アガロースゲル in TAE 泳動：100 V, 25分間 染色：EtBrの後染め
*目的遺伝子yのサイズは，約1500 bp である．
*培養細胞から抽出したトータルRNA 1000 ng をインプットとして cDNA 合成を行い，PCR検査には，200 ngのcDNAを使用した．
*PCR検査では，50 ngのプラスミドを使用した．
フールの解説
結果の見方の概要は，今回は省略します．
気になる方は，以前の記事を参照くださいませ．
波状のバンドの解釈
それでは，波状になったバンドの原因について考えてみましょう．
どうして，バンドの一部がウネウネしているのでしょうか？
レーン4と7で見られたバンドは，バンドが波状になっていますね．
これはPCR反応に原因があるのではなく，電気泳動に原因があります．
より正確に言うと，ゲルの作り方に問題があります．
実はこれ，ゲルからコームを外すときに，ウェルの一部が破壊されている証拠なんです！
コーム外す際にウェルが破壊される原因は3つあります．
- コームのお手入れができていない
- コームの取り外し方が雑
- ゲルの固化時間不足
コームのお手入れができていない
皆さんは，コームの歯をキレイにしていますか？
コームを取り外したら，ちゃんと洗浄していますか？
何も付いていないと考えて，DWで濯ぐだけってことはありませんか？
実は，コームにはアガロースが付着しています．
肉眼では何も付いていないように見えますが…
コームの歯をちゃんと洗浄しないと，付着したアガロースは乾燥するだけでコームの歯に残ったままです．
その乾燥アガロースは，次にアガロースゲルを作製する時に，作製されたゲルと結合します．
そして，コームを外すときに，乾燥アガロースの一部がウェルを破壊するのです．
洗浄するときは手袋を装着
時々，手袋を付けずに実験器具を洗う人を見かけます．
止めてください！
なぜなら，皮膚の角質を塗布しているだけだからです．
食器などを洗う場合は，それでも良いのかもしれませんが（笑）．
でも実験器具の場合，角質は立派な汚れです．
アガロースは落とした．
でも，角質は付着した．
意味ないですよね（笑）．
コームの取り外し方が雑
コームを外すときは細心の注意を払っていると思いますが…
忙しない時には雑になることもありますよね！
コームを，垂直ではなく斜めに引き上げたり，左右どちらかに偏った引き上げ方をしたりすると，ウェルが壊れる原因になります．
ゲルの固化時間が足りない
コームをゲルから外す前には，室温で最低でも1時間は静置してください．
急ぎの実験で，どうしても早めたい場合は，4℃で最低でも30分は静置してください．
トラブルシューティング
私が提案するトラブルシューティングは，以下の通りです．
① コームを洗浄する ② ゲルの固化時間を確保し，コームを丁寧に外す．
コームを洗浄する
実験室にあるコームを洗浄しましょう！
使用者が多くなればなるほど，器具を雑に扱う人も増えます．
明日は仕事納めのラボも多いと思うので，実験器具の煤払いを兼ねた全コームの洗浄も良いかもしれませんね（笑）．
固化時間を確保する
ゲルの固化時間をノートに書く人は多くありません．
私も「60分以上静置した」と書くことはありますが，正確な時間までは書いていません．
でも，もし固化時間に原因があると思うなら，ぜひタイマーを設定してください．
30～60分を確実に確保できます．
使用しているゲルにも，色々なクセがあるかもしれません．
一度時間を測って，ゲルを破壊しない最短時間を知っておくのもアリだと思いますよ！
以上，PCRのバンドが波状になったトラブルシューティングでした．
最後までお付き合いいただきありがとうございました．
次回もよろしくお願いいたします．
2020年12月27日 フール
